Un kit rapide de détection de la F.D. testé au cours de l’été 2014

23 juillet 2014

Anova-Plus est une toute jeune entreprise créée en avril 2013 dont l’activité est de développer des outils de détection des pathogènes destinés aux secteurs agricole et aquacole. L’émergence de nouveaux agents infectieux comme des phytoplasmes et des micro-algues toxiques provoque des affections souvent méconnues. L’expérience et les connaissances des quatre associés fondateurs de cette société concernent principalement les filières agricole, viticole et conchylicole. L’un des premiers projets développés est la mise au point d’un kit de détection rapide de la présence de phytoplasmes de la FD dans les rameaux et les feuilles des vignes en place et des parcelles de porte-greffe.

 

 

Les phytoplasmes sont malheureusement une famille de parasites qui touche de nombreuses cultures, la vigne, la lavande, le tabac, les tomates, la pomme de terre et des arbres fruitiers. Au niveau de la vigne, la flavescence dorée s’est malheureusement développée dans la plupart des vignobles français au cours de la dernière décennie. Les agents infectieux de la maladie sont des phytoplasmes spécifiques qui, d’un point de vue biologique, sont des bactéries dépourvues de parois. Ces micro-organismes ont la capacité de se multiplier au niveau du phloème, les tissus végétaux transportant la sève élaborée et aussi dans le corps de l’insecte vecteur, la cicadelle de la FD Scaphoïdeus titanus. L’insecte est inoffensif vis-à-vis de la vigne tant qu’il ne rentre pas en contact avec des souches contaminées. Comme beaucoup de ravageurs, il se nourrit de sève élaborée (riche en saccharose) en piquant les vaisseaux de phloème des feuilles. Les ceps contaminés représentent un « réservoir » potentiel d’agents infectieux et actuellement seul le repérage précis des symptômes permet d’éliminer cet inoculum. La multiplication des phytoplasmes dans les tissus végétaux (dans le phloème) provoque un ralentissement de la circulation de la sève élaborée qui s’extériorise par l’apparition de symptômes spécifiques au niveau des feuilles (décoloration), des rameaux (non-aoûtement) et des grappes (dessèchements précoces). Dès la localisation de ceps manifestant des aspects foliaires douteux, des prélèvements de feuilles sont envoyés à l’analyse dans un laboratoire accrédité pour confirmer la présence de la maladie.

Une méthode d’analyse officielle PCR validée par l’ANSES

L’ANSES (l’Agence nationale de sécurité sa-nitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail) a développé dans sa branche d’activité consacrée à la santé des végétaux diverse méthodes d’analyses officielles destinées à quantifier précisément la présence de pathogènes. Un test PCR d’identification de la présence des phytoplasmes responsables de la flavescence dorée a été établi et validé scientifiquement par le laboratoire du LNPV (directement dépendant du ministère de l’Agriculture). Des laboratoires privés proposent aussi de réaliser ces analyses en utilisant la méthode officielle. Les prélèvements d’échantillons de feuilles douteux sont transmis par la Poste au laboratoire qui s’engage à donner les résultats dans un délai de plusieurs semaines (2 à 3 semaines). La fiabilité de ces tests PCR est bonne mais leur mise en œuvre assez complexe et longue limite les performances des laboratoires et en renchérit le coût. C’est en faisant ce constat que les chercheurs de la société Anova-Plus se sont dits que la mise au point d’un test rapide pourrait rendre de gros services aux viticulteurs, aux techniciens chargés d’organiser la lutte et aux pépiniéristes.

Une détection de l’ADN des phytoplasmes de la FD en 45 minutes

Dès la création de la société en avril 2012, les quatre associés ont mobilisé leurs moyens sur la mise au point d’un kit rapide de détection des phytoplasmes de la FD. Leurs travaux ont débouché au cours de l’été 2013 sur une solution de diagnostic qui détecte l’ADN des phytoplasmes dans les tissus végétaux en moins de 45 minu-tes. Carine La, la directrice générale de l’entreprise, estime important d’avoir un outil analytique qui puisse être utilisé faci-lement par des techniciens de terrain : « Notre objectif est de proposer un test fiable et simple à mettre en œuvre qui soit adapté aux exigences des techniciens de terrain. Le fait d’obtenir un résultat analytique moins d’une heure après le prélèvement des feuilles suspectes ne peut que contribuer à rendre les stratégies de lutte plus efficaces. Actuellement, les délais pour avoir un résultat d’analyse avec la méthode officielle sont de 2 à 3 semaines. L’expérience scientifique acquise sur d’au-tres cultures agricoles nous a beaucoup aidés pour mettre au point le test ADN d’identification de la flavescence dorée. Au cours de l’été 2013, les premiers essais du kit rapide que nous avons conduits dans nos laboratoires ont été concluants. À partir des mois de juillet et d’août prochains, nous voulons tester le produit dans plusieurs zones viticoles pour évaluer sa sensibilité et sa robustesse en comparaison de la méthode officielle. »

Un kit de détection simple et facile à mettre en œuvre

Le kit de détection FD Anova-Plus est constitué d’une pipette de prélèvement, d’un tube testeur et de bandelettes colorimétriques. Au départ, il faut prélever 5 pétioles de feuilles provenant d’un ou plusieurs ceps extériorisant des symptômes. Les pétioles sont fendus en deux, puis mis dans une poche plastic où ils sont écrasés et broyés avec un pilon. Le jus de broyat est incorporé dans le tube testeur qui contient des enzymes et des oligonucléotides spécifiques. Le tube testeur est maintenu à une température constante de 39 °C pendant une demi-heure dans un bloc chauffant. Durant cette phase, le mélange d’enzymes et d’oligonucléotides au contact du jus de broyat de pétiole doit provoquer une multiplication des phytoplasmes si le pathogène est présent dans les tissus végétaux. À l’issue de cette phase d’extraction, une bandelette colorimétrique supportant le révélateur de l’ADN est plongée dans le tube testeur. Le changement ou pas de couleur des bandelettes permet d’obtenir immédiatement le résultat.

Le test va être définitivement validé au cours de l’été 2014

Les essais réalisés l’été dernier dans le laboratoire de la société Anova-Plus se sont révélés concluants, ce qui a incité les responsables de l’entreprise à s’engager dans les phases de validation définitive et de pré-industrialisation. Cette année, le kit rapide de détection de la FD va être confronté aux réalités du terrain pour démontrer sa fiabilité par rapport à la méthode officielle. C. La explique que la mise au point du kit a été conduite en s’entourant des conseils de plusieurs chercheurs et techniciens qui travaillent depuis longtemps sur la flavescence dorée : « Nous sommes bien conscients que la mise au point d’un kit d’analyse rapide pour la détection de la FD ne peut aboutir sans que l’on travaille en étroite collaboration avec les orga-nismes de recherche référents sur cette maladie. D’ailleurs, nous sommes en train de signer une convention de partenariat scientifique avec l’un de ces acteurs. On va également travailler avec des structures qui mettent en œuvre des stratégies de lutte sur le terrain, comme le GDON du Libournais et le GDON du Sauternais et des Graves, pour tester la fonction-
nalité et surtout la fiabilité de notre test en comparaison de la méthode officielle. » La société Anova-Plus pense commercialiser le kit de détection rapide à partir du début de l’année 2015 sous la forme d’un module complet comprenant la pipette de prélèvement des jus de broyat, les tubes testeurs et les bandelettes colorimétriques. Bien que le prix de vente ne soit pas encore totalement établi, les responsables indiquent que le coût du prix de revient d’une analyse pour les utilisateurs pourrait se situait entre 20 et 30 € HT. La société travaille actuellement à la mise au point d’un autre test ADN permettant à la fois de détecter de la FD et le bois noir.

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Les points clés du test rapide de détection de la FD ANOVA-PLUS
● Un kit de diagnostic simple, rapide destiné à être utilisé par les techniciens de terrain, les viticulteurs et les pépiniéristes.
● Le principe d’analyse qui repose sur la détection de l’ADN des phytoplasmes.
● Un équipement assez rudimentaire et simple : une pipette de prélèvement, un bloc chauffant, un tube testeur (contenant des produits spécifiques) et des bandelettes colorimétriques supportant le révélateur d’ADN.
● Un résultat obtenu 45 minutes après le prélèvement des feuilles.
● Des travaux scientifiques vont être conduits cet été pour tester la sensibilité et la robustesse par rapport à la méthode d’analyse officielle.
● Des premiers tests d’utilisation sur le terrain débuteront à partir de la mi-juillet avec les GDON du Libournais et du Sauternais.
● Le produit ne sera commercialisé que si les travaux scientifiques en cours confirment sa fiabilité.
● Un coût indicatif par analyse de 20 à 30 € HT.
● Contacts :
– Société Anova-Plus, 4 rue Pierre-Fontaine, Genopole, Campus 3, 91030 Évry cedex. Tél. 01 75 29 58 87/01 60 87 89 01.
– Mme Carine La, directrice générale : 06 07 55 25 18.
E-mail : carine.la@anova-plus.com
– Site : www.anova-plus.com

 

 

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